云南师范大学尚轶：高效的植物酶基因功能改良策略本专栏文章以观者角度阐释视频内容，凝练核心知识，以期帮助合成生物学爱好者更好地理解合成生物学前沿热点。

　　4 月 27~28 日，第四届工程生物创新大会暨第二届中国合成生物学学术年会暨首届亚洲合成生物创新大会在深圳光明科学城成功举办，本次大会以“合成生物：未来生物经济的引擎”为题。

　　非常荣幸有机会来介绍我们课题组最近做的一些工作，刚才袁老师的报告也说了，酶这块的工作进展不大，但对于合成生物学又特别重要，我们最近注意到这个问题之后，做了一点点尝试。

　　植物里面含有丰富的次生代谢产物，这些次生代谢产物不仅对人类的营养、健康非常重要，同时，它可以影响到作物的品质。实际上我之前一直是做作物品质育种研究的，合成生物学对我来说，实际上是半路出家。

　　我之前做的第一个项目就是黄瓜苦味的项目，葫芦素是一个三萜化合物，植物合成这个化合物是用来抗虫的，但如果它积累到果实里面，就会影响到果实的品质。同时，在甜瓜和西瓜里存在不同种类的葫芦素，它们的化合物结构非常像，但存在着不同的药用价值。

　　，也可以激活果实里的苦味合成。这个知识有什么用？可以提出一个兼顾品质和抗性的分子育种方案。

　　野生黄瓜的果实非常苦，通过驯化，可以把它变成不苦的。但这个驯化过程并不充分，当碰到逆境条件下，它的果实又会重新变苦。欧洲的育种家阻断了黄瓜里面合成这种苦味物质（的基因），虽然保证了品质，但是作物的抗虫性也丢失掉了。我们提出了兼顾品质和抗性的分子育种方案，比欧洲育种家做的方案更好。

　　有了黄瓜里的知识，我们同时也解析了甜瓜和西瓜里的整个代谢通路，把葫芦素B和葫芦素E的代谢通路也解析了出来，第一步是环化，后面全部是P450的修饰。通过一步一步的解析，同时我们也找到了关键的形成它们结构差异的P450基因，比方说这里面的这个基因在黄瓜里丢失了，而另一个基因在甜瓜和西瓜里丢掉了，这就是它们结构出现差异的非常关键的两个P450基因，现在还有一步的反应还不清楚。

　　另外就是最后的乙酰基转移，目前我们发现了3个三萜环化酶、14个P450和3个乙酰基转移酶。我们还对葫芦素结构进行了修饰，发现糖基转移酶可以降低其毒性。

　　最新的研究，我们也解析了葫芦素的转运。它在甜瓜里，可以排到土壤里，改变土壤的根际微生物结构，提高植物的抗病性。在黄瓜里，可以把葫芦素储藏在液泡里，因为葫芦素是有一定毒性的。

　　在做以上这些工作的过程中，我们注意到了合成生物学这门新的学科，尤其是这两篇文章，我们觉得它非常震撼。

　　还有一个问题，我们从植物里面发现的酶，它在微生物里做合成的时候，存在适配问题，所以我们从合成生物学的底盘菌开始做起。这个工作是用酿酒酵母做的，是一个非常简单的工作，添加5碳底物，增加两个激酶天博体育官网，就创造了一个新的短途径的合成萜类化合物的前体，这个前体就可以用来做萜类化合物的合成底盘菌。

　　另一个工作是用解脂酵母做的，这个工作中（合成的）角鲨烯可以达到20g（/L）以上。这个项目里有两个创新，一是我们在过氧化物酶体里构建正交的MVA途径，用这两个酶（MvaE，MvaS）代替上游的HMG2，ERG10和ERG13。在此基础上，我们进一步利用了解脂酵母里含有丰富的脂肪，在这个脂质小体里有大量的TAG，通过降解TAG，给过氧化物酶体里的反应提供大量的乙酰辅酶A。同时因为前期消耗了大量的TAG，需要补充TAG，所以我们前期加强了线粒体里柠檬酸外排的作用。

　　通过以上三个方面的优化，角鲨烯可以达到32克/升。还有一个创新，是用醋酸合成乙酰辅酶A，因为,醋酸的结构相对来说更简单。同时，我们可以用过氧化物酶体，快速拿到一些辅酶A。但它有一个问题，用醋酸来培养酵母的话，它的生长会很缓慢，所以我们又开发了co-feeding体系，跟葡萄糖共培养。这个体系方案，最后的角鲨烯也能达到31克/升。

　　接下来介绍一下我们植物酶的改良策略，主要是基于De novo蛋白设计软件Rosetta，以及海量进化的信息。当时做的时候，AlphaFold还没有出来，现在我们已经把它加到我们最新的策略里了。最开始我们做这个策略的时候，首先我们选了非常简单的三萜环化酶进行改造，这里面有两个环化酶，一个是合成葫芦二烯醇（OSC），一个是合成胆固醇（LAS）。

　　。同时，我们也试了一下氨基酸共进化信息对酶改造到底靠不靠谱？发现确确实实，氨基酸共进化信息，对于我们做酶改造非常重要。

　　另外，我们开始做植物P450酶的理性设计。我们选了一个体系，即我们之前做的葫芦素和罗汉果苷，因为它们的结构非常相似。

　　这个是罗汉果醇的合成途径，这里面有两个关键的羟基的修饰。上面是我们做的P450的酶，同样也有一个修饰，但这个地方是羰基，我们想借用这个酶进行改造，让它只合成羟基就行了，另外借用上面这个酶识别新的底物，由此就可以产生新的途径，这就是我们这个项目的初衷。

　　最终我们对P450进行了三轮改造，这个图（图1）最上面是野生型的情况，我们的目的是要拿到11H-C这个化合物。三轮总共有96个突变，就实现了。我们把Rosetta和氨基酸共进化信息都放到了论文里。我们还注意到，其中有一个酶的表达量特别低，但催化效率又特别好，没有杂物，所以我们又对这个蛋白表面的氨基酸做了优化的过程（图2）。做了四轮，17个突变，就实现了改造，它的效果还是非常好的。第一个是野生型，旁边（箭头所指）的就是我们突变的P450的情况。

　　我们也提出了植物P450酶理性设计的改造目标，大部分都已经实现了，还有两个部分没有实现，一个是高通量的筛选，另一个是机器学习。

　　我们用这套体系做了几个工作，其中一个是提高β-胡萝卜素的产量，原来的β-胡萝卜素环化酶有底物抑制的情况，我们用这套方法设计了50个突变，其中一个突变就可以大量产生β-胡萝卜素，因为它的突变影响了酶的跨膜结构。

　　另一个工作，在解脂酵母里有大量的脂肪酸，脱羧酶的最适底物是16个碳的底物，但是在酵母里它是碳18的脂肪酸更多，所以我们对于脱羧酶的空间进行了优化，优化之后，它就可以接受碳18分子。同时再加上工艺的优化，现在它可以产生大量的烷烃。

　　还有一个工作，刚才袁老师也提到了，就是我们做的紫杉醇合成生物学，这里面几步都可以改造，第一步是环化酶，第二步是P450的羟基酶，还有一个TAT，我今天要介绍的就是TAT这部分的工作。我们开发了一个高通量的筛选机制，用GFP做指示，设计了180个突变，做完之后的数据，我们给机器学习去进行学习，同时做拟合，我们尝试把高通量体系跟蛋白稳定性的提高融合起来。

　　以上介绍的，都是我们做植物天然产物这块的应用，其实酶改造也可以用在育种里。我们做了“Potato2.0”，这是我们现在在云南开展的工作，把马铃薯由块茎繁殖变成种子繁殖，也有评论说“这是真正改变游戏规则的”。

　　要把它变成种子繁殖，第一件事情就要做自交系，马铃薯是自交不亲和的，我们前期克隆了一个非常重要的基因，可以让它产生自交系，

　　这是我们用AlphaFold做的，我们做的SLF-C复合体是非常完美的，它是通过泛素降解把锁打开。

　　这个（S-RNase4/9）相当于锁，旁边的（Sli）相当于钥匙，我们已经把它缩小到非常窄的区域了。一个锁能打开，另一个锁不能打开，我们就可以做蛋白互做的结构模拟，进而对蛋白进行修饰，这就是我们想做的（Sli的）理性设计与“”，希望它可以打开更多的锁，就可以创造更多的自交性，因为做育种很重要的一点，就是要做它的遗传多样性。

　　最后一个例子是马铃薯的储藏蛋白。大家都知道，我们去年大豆的进口超过1亿吨，但马铃薯蛋白的营养，从关键的指标来看，比鸡蛋还高。美国的建明（Kemin）公司就用马铃薯其中的一个主蛋白叫蛋白酶（开发成了一种保健食品），它可以促进胆囊收缩素的分泌，提高大家的饱腹感。

　　马铃薯蛋白的主要成分，一个是Patatin，另一个是蛋白酶，我们挑选了其中Patatin做研究。其实关于Patatin的研究非常少，我们用Alphafold做了简单的预测，它是形成一个二聚体，而且对它的互作界面进行分析，确实是符合要求的。

　　我们进一步对Patatin的营养成分和黏度进行设计，里面加的是半胱氨酸，可以提高Patatin蛋白的营养。同时黏度也是对于食品来说非常重要的标准。它（野生型的Patatin）在还原力的作用下不能形成外围的二聚体，我们通过设计加上了半胱氨酸，可以看到它加上之后的黏度（大幅提升），可以包裹更多的淀粉。

　　最后，回到主题，今天讲合成生物学和经济，其实《经济学人》期刊专门有一期介绍合成生物学，称它为“重新设计生命”并评价它非常值得期待。我们觉得非常好，

　　，包括今天好多老师介绍的研究，以及我们的食品研究，如何这些能结合起来的话，那真的是非常好的一个事情。

　　最后是致谢，葫芦素还有底盘菌的构建，主要是MIT的马永硕博士完成的，酶理性设计主要是我们的深圳基因组所团队，Sli基因研究主要是我们云师大团队完成的。我们在做的过程中，得到了很多老师的支持，感谢。