天博体育Nature 转座酶辅助下的高效植物基因组整合技术—TATSI已经被广泛用于基础研究和作物改良，传统的转基因整合发生在基因组中的位置被认为是随机事件，可能引起意外的突变或存在位置效应，所以实现特异性靶位点的基因组整合需求急迫【1,2】。目前有多种方法可以实现特定位置的转基因插入，如同源重组技术（HR），但是HR在植物中的效率低下，一直未有较大突破【3】；可编程核酸酶系统如CRISPR-Cas的出现，提高了靶向整合的能力，但是也存在插入片段较小，概率低下的问题【4】。II类DNA转座子（TE）编码转座酶蛋白，可以从供体位置切除相应DNA，并将其准确地插入基因组中新的整合位点【5】。前期报道，利用蓝藻中CRISPR相关转座酶实现了大肠杆菌中的高效靶向基因整合【6-8】。但是在植物中实现高效基因组定向整合仍然面临挑战

　　在该研究中，作者受细菌中CRISPR相关转座酶靶向可编程区域的启发，将水稻来源的Pong转座酶蛋白与可编程核酸酶Cas9和Cas12a融合表达，在前期构建的拟南芥转基因株系中进行功能验证，经过两步转化和基因型鉴定，证明了不同的核酸酶可以与Pong转座酶蛋白结合来进行靶向整合。为了判断基因整合过程中，水稻转座子基因mPing到靶标位点PDS3基因靶向的准确性天博体育官网，研究人员对该事件进行了深度扩增子测序分析，数据显示，mPing在靶向插入后是完整的，插入后mPing和靶位点DNA交界处的碱基上出现了小的缺失，这些小的缺失可能是由非同源末端连接（NHEJ）在修复整合连接过程中引起的。为了研究除了CRISPR-Cas靶位点外，mPing插入是否发生在基因组的其他区域，研究人员进行了插入测序（insertion-seq），以鉴定拟南芥基因组中所有的水稻mPing插入位点，分析结果说明，在PDS3以外的其他位置的mPing插入是由活跃的mPing转座系统产生的自由转座事件，而不是CRISPR-Cas9非特异性切割的位点。随后，进一步探究TATSI的可编程性，作者证实了该系统可以实现多个位点的同时靶向整合，但是未能检测到靶位点发生甲基化事件，作者猜测靶位点没能实现甲基化的原因可能是所用TE为外源，而此次转座事件是非自主的。研究人员进一步评估了TATSI靶向整合的效率，在拟南芥中，使用单组分系统进行靶向插入的效率可以达到35.5%，与其他类型的基因组整合技术比较后分析发现，TATSI较高的靶向效率可能是由于染色体外mPing元件的转座酶结合的原因。随后，作者探究了TATSI可以靶向整合片段大小的能力，实验结果证明：标准的mPing元件（430bp），含有六个热休克元件（HSEs）的mPing_HSE元件（444bp），含有bar基因编码区的mPing_bar_CDS元件(1002bp)，含有bar基因表达盒（包括启动子和终止子）的mPing_bar元件(1563bp)，较大的mPing_EPSPS元件(8.6kb)都可以通过TATSI系统成功实现靶向插入，但是携带越小的货物靶向插入效率越高。最后作者在大豆中实现了高达18.2%的靶向插入效率，证明TATSI系统拥有广阔的商业应用价值。

　　综上所述，该研究利用了TE的自然转移能力，共表达水稻Pang DNA转座子系统和Cas9/Cas12a，开发出TATSI系统，实现了模式植物拟南芥和农作物大豆高效靶向整合，显著提高植物基因组编辑的效率和准确度，为作物性状改良和新品种培育提供了优良的工具。